啟動子cag的作用？
【摘要】:基因治療,尤其是腫瘤的基因治療目前是人們關注的熱點.重組aav病毒載體由於其獨有的優勢而在近些年來被認為是最理想的病毒載體之一,本實驗室利用重組aav病毒進行肝癌及肺癌的基因治療研究也取得了一些比較理想的結果.在基因治療中,靶向性是非常重要的問題.在我們既往利用的重組aav病毒載體中,外源基因的表達是通過cag啟動子來驅動的,cag啟動子是一個組成型啟動子,在幾乎所有細胞中都能驅動外源基因的表達,缺乏良好的選擇性,因此,我們希望對cag啟動子進行改造,來更好的實現以重組aav病毒為載體的靶向基因治療,以避免外源基因對正常組織器官的傷害.本研究中,我們構建了兩種腫瘤特異啟動子,即人端粒酶逆轉錄酶單位(htert)啟動子和存活因子(survivin)啟動子,比較研究了它們在體內、體外驅動外源基因表達的情況及對細胞生命活動的影響.(一)含有腫瘤特異啟動子的重組aav載體的構建及其活性研究我們構建了htert啟動子或survivin啟動子與aav2的重組質粒載體.通過報告基因egfp的表達比較了兩種腫瘤特異啟動子在不同肝細胞癌(hcc)細胞株及人原代正常肝細胞(phh)中的活性,結果表明htert啟動子與survivin啟動子均能驅動egfp基因在hcc細胞中的表達,htert啟動子驅動的egfp表達在smmc-7721、bel-7402、hepg2和hep3b肝癌細胞中的平均熒光強度分別為44.4%、32.7%、35.2%和12.9%,survivin啟動子驅動的egfp表達在四株細胞中的平均熒光強度為25.4%、21.8%、13.5%和11.7%,雖然這兩種啟動子之間的活性有所差別,但它們在phh中均沒有活性,平均熒光強度在5%以下.此外,兩啟動子驅動的trail基因還可引起不同程度的hcc細胞存活率降低,而對phh並無影響.進一步,我們又對htert啟動子在包括肺癌、結腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、白血病等不同種類的腫瘤細胞株及正常細胞中的活性進行檢測.結果表明,htert啟動子在多種腫瘤細胞中均有活性,而在正常細胞中則沒有,說明它具有良好的腫瘤特異選擇性.(二)含有腫瘤特異啟動子的重組病毒的制備及其功能研究我們還通過包裝純化重組aav病毒顆粒,進一步研究了htert啟動子驅動的aav.trail重組病毒單獨作用或與化療藥物5-fu聯合作用的情況.經對重組病毒侵染後的腫瘤細胞及正常細胞dna、mrna及蛋白分析的結果表明,htert啟動子可驅動trail基因在腫瘤細胞中特異表達.抗腫瘤活性分析表明,重組病毒侵染72小時後,肝細胞癌smmc-7721細胞、肺癌a549細胞、宮頸癌hela細胞和正常人肝細胞phh的凋亡率分別為:smmc-772157.4%、a54922.9%、hela33.3%、phh4.9%.應用裸鼠移植瘤模型進行的體內研究結果表明,htert啟動子驅動的trail基因表達明顯抑制smmc-7721人肝細胞癌在小鼠體內的生長,5*10~(11))gps重組病毒可使腫瘤增長抑制率達77%,而且,htert啟動子驅動的trail基因表達也能明顯抑制a549人肺腺癌細胞在小鼠體內的生長.應用化療藥物5-fu與重組病毒聯合給藥結果表明,40mg/kg的5-fu能增強重組病毒抗腫瘤作用,腫瘤增長的抑制率達到90%.免疫組織化學分析顯示,5-fu能增強腫瘤組織中trail受體dr5的表達.此外,我們還觀察到htert啟動子驅動的trail表達具有給藥途徑的選擇性,即局部瘤內注射有效而系統給藥(尾靜脈注射和肌肉注射)則無效.我們還對htert驅動的aav.trail進行了安全性檢測.病理分析及轉氨酶測定表明,無論是瘤內注射還是系統給藥,重組病毒對動物正常組織器官尤其是肝髒沒有影響,說明在htert啟動子驅動下,重組病毒是安全的.綜上,我們的研究表明腫瘤特異啟動子能特異性驅動外源基因在腫瘤細胞中的表達及效應.在腫瘤特異啟動子驅動下,重組aav病毒能使外源基因trail安全有效的發揮作用,這為實現以重組aav病毒為載體的腫瘤靶向性基因治療提供了新的思路.
|
|
